一,、原理

　　當(dāng)光線通過一個渾濁介質(zhì)溶液時，由于溶液中存在混濁顆粒,，光線被吸收一部分,，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測定光吸收量的方法稱為透射比濁法,。這一方法早于1959年Schultre和Schuick等報道應(yīng)用于血漿蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物,，導(dǎo)致濁度的改變，再進(jìn)行透射比濁測定,，一般采用抗體對抗原定量的透射比濁法,，稱為免疫透射比濁法,。其原理是，利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物,，通過測定復(fù)合物形成量的多少對抗原或抗體進(jìn)行定量的方法,。在介質(zhì)溶液中，抗原與特異性抗體在一定條件下才能形成復(fù)合物,，一定的條件包括：①對抗體的要求,，作為體液或組織中蛋白質(zhì)種類很多，若要快速特異檢測,，要求有單價特異抗體才能與抗原形成復(fù)合物,。某一種蛋白質(zhì)，有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合,，形成免疫復(fù)合物進(jìn)行定量,，若抗體不純混雜有另一種或兩種少量的抗體，這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜燴,，結(jié)果偏高;②抗原抗體比例適當(dāng),，因免疫復(fù)合物形成有三個階段，第一階段是復(fù)合物形成抗原抗體復(fù)合物;第二階段是初步形成抗原抗體復(fù)合物,，此階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu);第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀,。只有在抗原與抗體等價時即無過剩抗體,，此時,，復(fù)合物的結(jié)合與解離處于平衡狀態(tài)，其混濁程度達(dá)高峰,。在抗體過量時,，隨抗原量的增加而復(fù)合物形成也增加，其測定只能在反應(yīng)曲線的左側(cè)進(jìn)行(見圖18-4);③一般要求溶液中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成,，如聚二乙醇6000等,。溶液pH為6.5～8.0之間為宜。載脂蛋白有形成兩性螺旋片(amphipathic helix)的特性,，對脂質(zhì)(特別是磷脂)有高度親和力,，與脂質(zhì)結(jié)合后有時會掩蓋抗原位點或構(gòu)象改變,，可以部分或完全喪失對抗血清的特異反應(yīng)。為此,，載脂蛋白檢測過程中有必要先暴露抗原位點，所用試劑有表面活性劑,，尿素，鹽酸胍和吐溫等解離蛋白劑,，或用四甲基脲脫脂或有機(jī)溶劑脫脂等暴露抗原決定簇等方法,，血清脂蛋白顆粒中的載脂蛋白，能在短時間內(nèi)形成抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行定量;④抗原不能過量,，因為抗原過量,，抗原抗體復(fù)合物形成不但不增加,，反而會減少，光散射或光吸收減少,，檢測結(jié)果反而偏低,。

　　圖18-4 抗原抗體反應(yīng)曲線

　　在免疫比濁過程中,，由于抗原抗體結(jié)合的三過程，從而導(dǎo)致光密度與濃度之間不呈線性關(guān)系,，一般是3次方程曲線關(guān)系,。若將抗原與抗體兩個變量之間的變動特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜恚枰?jīng)過3次方程擬合成近似直線化的曲線方程,，再進(jìn)行運(yùn)算，免疫比濁中,，采用終點法或速率法,，用5個或7個不同梯度進(jìn)行定標(biāo),，經(jīng)3次曲線方程求出一條能反映真實情況的濃度與光密度的關(guān)系曲線方程，才能作為定量的工作曲線,。

　　二、血清ApoAⅠ(B100)透射比濁測定法

　　脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒,，分散于溶液介質(zhì)中，在一定波長下測定其混濁程度,，進(jìn)行ApoAⅠ(B100)的定量測定,。

　　(一)手工操作

　　1.原理

　　血清ApoAⅠ(B100)+抗人ApoAⅠ(B100)→抗原抗體復(fù)合物→測定光密度

　　2.試劑(伊利康)

　　(1)Apo緩沖液(RⅠ)，含4%PEG6000和表面活性劑

　　(2)羊抗人ApoAⅠ(B100)抗體液(RⅡ)：監(jiān)用前取抗血清200μl,，加0.9%NaCl液700μl，混勻,，待用，置冰箱一周內(nèi)有效,。

　　(3)ApoAⅠ(B100)參考血清(RⅢ)

　　3.操作

　　(1)按ApoAⅠ抗血清液或ApoB100抗血清100μl，加相應(yīng)的Apo緩沖液0.9ml的比例混合成單一試劑(Apo抗體液),。最好臨用前配制當(dāng)天用量,。

　　(2)各試劑用量如下表

　　ApoAⅠApoB100

　　標(biāo)準(zhǔn)管測定管空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管空白管

　　參考血清5μl　　5μl

　　待測血清　5μl　　5μl

　　ApoAⅠ抗體液1.0ml1.0ml1.0ml

　　ApoB100抗體液　　　1.0ml1.0ml1.0ml

　　混勻各管,，37℃保溫10min,，波長340min，于半自動分析儀上先吸入空白管液,，再吸入標(biāo)準(zhǔn)管,，儀器根據(jù)光密度及參考值得出一換算系數(shù)，再吸入測定管，儀器內(nèi)根據(jù)光密度及系數(shù)進(jìn)行運(yùn)算,，打印結(jié)果,。

　　(3)定標(biāo)方法,，根據(jù)免疫比濁法原理,，應(yīng)取多點(3～9點)，按y=a+bx+cx2+dx3的3次方程回歸曲線進(jìn)行定標(biāo),，制作參考工作曲線。

　?、傩Ｕぷ髑€的繪制：

　　配制抗血清稀釋工作液：按RⅠ試劑0.9ml,，加RⅡ試劑100μl的比例(Apo抗體液)混勻,，待用。

　　制備5點校正液：取RⅢ(參考血清),，用0.9%生理鹽水倍比稀釋成5個濃度,，第5管為原參考血清濃度，其他4管分別為第5管的1/2,、1/4,、1/8、1/16(或濃度為0即0.9%NaCl),。

　　表18-20 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的各管(點)濃度

　　管號12345

　　1號管(0)(μl)5

　　2號管(1/8)(μl)　5

　　3號管(1/4)(μl)　　5

　　4號管(1/2)(μl)　　　5

　　5號管(1/1)(μl)　　　　5

　　Apo抗體液(ml)1.01.01.01.01.0

　　混勻各管,，置37℃水浴保溫10min，按程序上機(jī)作工作曲線,。

　?、跇?biāo)本測定：吸待測血清(測定管)5μl，加上述稀釋抗血清工作液1.0ml,，于37℃水浴保溫10min,，上機(jī)讀數(shù)，打印結(jié)果。

　?、廴鐪y定值超過工作曲線上限值,，儀器會打印顯示“過高”,，此時,，將待測標(biāo)本稀釋1倍再測。

　?、苊颗柕目寡鍛?yīng)作一次多點定標(biāo)，即測定標(biāo)本的抗血清應(yīng)與定標(biāo)的抗血清是同一批號抗血清,。

　　(二)生化分析儀測定

　　1.原理

　　脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒分散于溶液介質(zhì)中，在一定波長下測定其混濁程度,，進(jìn)行ApoAⅠ(B100)的定量測定。

　　ApoAⅠ(B100)+抗人ApoAⅠ(B100)→抗原抗體復(fù)合物→測定吸光光密度

　　2.雙試劑單(雙)波長法

　　(1)試劑(溫州伊利康)

　　RⅠ：Apo緩沖液,，含4% PEG6000和表面活性,。

　　RⅡ：羊抗人ApoA(B100)稀釋抗血清

　　RⅢ：Apo定值血清

　　(2)各試劑及標(biāo)本用量如下表：

　　項目血清Apo緩沖液

　　(RⅠ)ApoAⅠ抗血清液

　　(RⅡ)ApoB100抗血清液

　　(RⅡ)

　　ApoAⅠ2～5μl300～350μl80～100μl

　　ApoB1002～5μl300～350μl　80-100μl

　　(3)定標(biāo)：以5點Apo梯度濃度，采用免疫定標(biāo)法按表18-21參數(shù)上機(jī)定標(biāo)，如圖18-5所示,。

　　圖18-5 ApoAⅠ 五點免疫定標(biāo)曲線圖(以CL-7200儀器為例)

　　(4)上機(jī)(終點法或兩點法)

　　(5)說明：①Apo測定的光密度從340～700nm范圍都可采用，多用340nm;②國內(nèi)已有的Apo試劑盒均無需處理;③血清標(biāo)本也無需處理,，均可直接檢測;④本法適用于多種類型的全自動生化分析儀檢測，自動扣除空白,，快速準(zhǔn)確;⑤效價不同的抗血清，其用量應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整,。

　　(5)計算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定標(biāo)自動運(yùn)算。

　　3.單一試劑單波長法

　　(1)試劑同雙試劑法

　　(2)標(biāo)本及試劑用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相應(yīng)的Apo緩沖液(RⅠ)0.3ml的比例混合成單一試劑(Apo抗體液),。最好臨用前配制當(dāng)天用量,此抗體液置2～8℃保存一周有效,。

　　(3)定標(biāo)：按五點梯度稀釋定值血清(見表18-21)，以終點法或兩點法進(jìn)行免疫定標(biāo),。

　　(4)按以下步驟操作：

　　(5)以△A=A2-A1值按免疫定標(biāo)自動運(yùn)算,。

　　(6)說明：①該法一般用半自動生化分析儀;②通過設(shè)延遲時間以扣除空白;③RⅠ、RⅡ試劑以臨用時混合為好,，未用完的混合試劑應(yīng)置于2～8℃冰箱保存,，只允許使用一周;④血清標(biāo)本無需再處理,。

　　4.ApoAⅠ、AⅡ,、B,、CⅡ,、CⅢ和E的全自動生化分析儀檢測的有關(guān)數(shù)據(jù),。

　　(1)上機(jī)參數(shù)(以CL-7200型為例)如表18-21所示,。

　　表18-21 自動生化分析儀檢測Apo有關(guān)參數(shù)

　　ApoAⅠAⅡBCⅡCⅢE

　　反應(yīng)類型終 點法

　　樣品量3μl3μl3μl8μl3μl5μl

　　測量波長600nm(第一)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)700nm700nm700nm

　　700nm(第二)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)340nm340nm340nm

　　反應(yīng)時間第一波長5min數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)

　　第二波長4.99min數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)

　　試劑Ⅰ350μl290μl350μl300μl290μl350μl

　　試劑Ⅱ100μl75μl100μl50μl75μl50μl

　　單位g/Lg/Lg/Lmg/dlmg/dlmg/dl

　　標(biāo)準(zhǔn)濃度點數(shù)555555

　　(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參數(shù)如表18-22所示,。

　　表18-22 生化分析儀檢測Apo的定標(biāo)濃度

　　標(biāo)準(zhǔn)管號123456

　　稀釋倍數(shù)01：21：41：81：160

　　ApoAⅠ度數(shù)(g/L)172864321.510.80

　　ApoAⅡ度數(shù)(g/L)361894.52.250

　　ApoB濃度(g/L)1809145.522.611.30

　　ApoCⅡ濃度(mg/dl)4210.50.250

　　ApoCⅢ濃度(mg/dl)52.51.250.630.310

　　ApoE濃度(mg/dl)1052.51.250.6250

　　5.單一試劑和雙試劑檢測方法的比較

　　單一試劑和雙試劑在全自動生化分析儀測定的光密度變化過程,，如圖18-6所示,。

　　從理論上考慮任何一種生化測定方法的試劑，臨用時混合最好,，可以消除試劑各種成份的自身化學(xué)變化和相互影響。而在實際工作中,，是不可能的,，只能是將幾種不會起化學(xué)反應(yīng)而又無相互影響的試劑配制成2～4種,，臨用時按一定比例配制使用,。臨床化學(xué)試劑盒,，目前主要以1或2種試劑形式供醫(yī)學(xué)檢驗使用,，即單一試劑和雙試劑兩種形式。

　　筆者認(rèn)為雙試劑比單一試劑好,，尤其是含酶試劑和免疫試劑以雙試劑包裝形式為好，有利于對酶的活性或抗體效價的保存,。單一試劑是所有試劑混合在一起,，存放過程中,，有可能因化學(xué)物質(zhì)的存在而損害試劑中的工具酶或抗體,，存放時間越長，損害可能性越大,，然而雙試劑不存在這一問題,。

　　對脂質(zhì)的測定雙試劑法更顯其優(yōu)越性，因為血清中脂質(zhì)與載脂蛋白是以脂蛋白的形式存在,，當(dāng)測定試劑與血清標(biāo)本混合后,，首先解聯(lián)脂蛋白，讓其釋放出脂質(zhì)和載脂蛋白,，,。作為免疫測定試劑還兼有使載脂蛋白抗原決定簇暴露的作用,。當(dāng)R1試劑作用完后，加進(jìn)第二試劑(R2)后,，使其抗體適應(yīng)抗原決定簇的要求,，達(dá)到抗原抗體結(jié)構(gòu)呈完全的互補(bǔ)狀態(tài)，從而產(chǎn)生最大的抗原抗體結(jié)合量,，達(dá)到定量的目的,。雙試劑測定法，既能自動扣去空白,，又能使化學(xué)反應(yīng)快速進(jìn)行,，從而迅速地完成檢測的全過程。

　　圖18-6 單雙試劑法反應(yīng)過程的光密度變化曲線圖

　　A：雙試管法;B：為單一試劑法

　　(賀小玲　胡漢寧)